结构光照明显微镜(SIM)可提供快速、长时间的超分辨率成像，但其性能从根本上受到样品引起的像差的限制，这些像差在大视场和成像深度范围内变化。文献提出了一种基于傅里叶叠层成像的辅助结构光照明显微镜(FP-SIM)，这是一种自适应光学(AO)辅助的大视场SIM，它利用傅里叶叠层成像(FP)技术对空间变化的像差进行原位校正。FP-SIM利用FP的定量相位恢复能力，直接从相干、无标记测量中重建瞳孔相位图，并将其应用于荧光SIM重建，从而在不依赖荧光引导信号的情况下实现精确的像差校正。该方法利用相干测量进行无引导星的逐块波前传感，从而在大视场范围内实现高分辨率荧光成像。对各种样品的实验验证表明，与目前最先进的拼接式和陷波滤波SIM方法相比，该方法在分辨率、对比度和伪影抑制方面均有显著提升。除了提供一种互补的无标记成像方式外，FP-SIM还为大规模、深度分辨、抗像差荧光显微镜提供了一种多功能且灵活的解决方案，具有高成像保真度。该项工作在ACS PHOTONICS上以“Adaptive Optics-Assisted Large-Field Structured Illumination Microscopy via Coherent Aberration Sensing”为题发表。
SIM由Gustafsson以及Heintzmann等人开创，通过采用图案化照明和计算重建技术，SIM克服了传统荧光显微镜的衍射极限。由于其卓越的光子效率，SIM已成为活体超分辨率成像的关键技术，能够对活细胞动态进行高分辨率可视化，并已成功实现商业化。为了提高SIM的性能，人们开发了各种先进技术，包括TIRF-SIM用于抑制离焦荧光；GI-SIM用于高分辨率表面成像和Hessian-SIM和稀疏SIM以进一步提高分辨率。同时，传统的SIM通常在有限的视场范围内工作(<100 μm)。这限制了其在大规模生物学研究（例如组织成像和病理分析）中的应用。为了克服这一限制，研究人员通过引入波导以及专用光学元件开发了大场SIM技术，实现了大范围高通量成像。除了荧光成像之外，SIM还成功集成到无标记成像模式中，实现与活细胞相关的成像，同时提供结构和动态信息。
展开剩余85%尽管SIM技术取得了进步，但其性能仍然受到样品异质性（如厚度变化和折射率不均匀性）引起的光学像差的根本限制。在厚样本或大视野样本中，这些像差问题尤为突出，因为来自不同空间位置的荧光会沿着不同的光路传播，导致复杂的、空间变化的波前畸变。这些像差会扭曲检测到的信号，造成对比度损失、分辨率下降和重建伪影。
针对大视场SIM图像质量下降的问题，已开发出多种计算策略。分块SIM重建以及照明参数估计这些方法侧重于校正条纹图案中的空间不一致性，但忽略了检测路径中的像差。人们也探索了陷波滤波器，HiFi-SIM，以及其他光学传递函数(OTF)修正策略的方法加速重建和抑制伪影。然而，这些方法大多依赖于理论系统模型或从荧光微珠校准的点扩散函数(PSF)。这些方法仅反映系统层面的偏差，而无法捕捉样品引起的畸变。这些样品引起的偏差高度依赖于具体情况，无法用静态物理模型精确描述。当偏差严重扭曲实际的OTF时，传统的SIM重建方法将变得不可靠。
为了解决这个问题，人们采用了AO技术。基于导星的AO系统，例如使用非线性或共焦点光源的系统，虽然可以提供局部像差校正，但由于信号不足，在散射组织中存在根本性的局限性，并且由于其复杂性和采集时间，不适用于大范围宽场应用。例如，Lin等人用于SIM的无传感器AO方法提供了一种无需导星的替代方案，并且可以在高度像差的样品中运行。文献提出了一种基于共聚焦光斑的无传感器AO方法，该方法提高了对空间非均匀信号的鲁棒性。然而，此类技术通常对整个图像进行单次波前校正，因此不足以处理大视野范围内空间变化的像差。总之，在大成像区域内对空间变化的像差进行原位校正，仍然是高性能SIM以及更广泛的荧光成像领域尚未解决且亟待解决的挑战。
在本研究中，作者提出了一种新型的SIM方法——FP-SIM，该方法集成了FP技术。为了实现原位、无导星的传感和空间变化像差的校正，FP是一种计算成像技术，它通过结合一系列在不同照明角度下采集的强度测量值，重建光场的振幅和相位。通过迭代相位恢复，FP能够在较大的视场范围内实现高相位恢复精度和定量瞳孔重建。无需额外的波前传感器或荧光导星，这使得FP技术尤其适用于大尺寸、厚实的生物样本，因为在这些样本中，像差会随空间变化，而传统的AO方法往往无效。通过利用FP的相位恢复能力，作者直接从相干、无标记成像中重建瞳孔相位图，并将其整合到荧光SIM重建中，从而在不依赖荧光信号的情况下增强像差校正。为了实现高通量、大视场成像，作者采用了定制设计的物镜，使FP-SIM能够在保持高分辨率的同时达到约1 mm的视场。FP和SIM无缝集成到一个联合重建流程中，实现了跨模态信息流，从而提高了校正精度和图像保真度。作者在包括结构化标准靶标和复杂生物样本在内的多种样本上验证了FP-SIM，结果表明其在对比度、分辨率和伪影抑制方面均表现出始终如一的优异性能。
FP重建利用多照明数据集中的冗余信息，迭代地重建物体的复像场和空间变化的瞳孔像差，能够直接原位表征样品引起的波前像差。为了确保精确的SIM重建（SIM重建对OTF建模误差尤其敏感），作者引入了FP-SIM，这是一种自适应计算方法，它将基于FP的波前传感直接集成到SIM重建流程中，如图1所示。FP模块可实现原位波前传感，从而校正荧光SIM中空间变化的像差。在FP模块中，多角度相干照明采集原始无标记数据，并从中重建高对比度相位图像和瞳孔相位图。这些空间变化的像差图被整合到SIM重建流程中，从而可以逐块校正样品引起的像差。最终输出是在大视场范围内具有更高对比度和更少伪影的高分辨率SIM图像。
在SIM中，结构光照明下的成像过程可以描述为：g(r)=[s(r)×t(r)]*ho(r)，其中，s(r)为目标物体，t(r)为结构光强度分布，ho(r)为非相干PSF。大多数现有的SIM实现仅使用预校准的PSF（通常由荧光微珠获得）来校正系统级像差。然而，这种方法无法解释样品本身引入的空间变化像差，只能捕捉到较小的系统级像差，而这些像差通常并非SIM图像退化的主要原因，正如图2(a)所示。此外，基于微珠测量的PSF存在采样分辨率低的问题，使其无法捕捉复杂的光学畸变。这些局限性在厚而大的生物样本中尤为突出，因为不均匀的折射率和光散射会显著加剧像差效应。作者比较了由荧光微珠和FP传感得到的OTF，如图2(b)和(c)所示。基于微珠的校准主要捕捉低频系统像差，并假设其在整个成像场中具有空间不变性。相比之下，从FP传感中提取的OTF的合成能够对样品引起的像差进行原位表征，这些像差主要影响高频分量，并在成像场中随空间变化，如图2(d)所示。
为了克服这些局限性，作者提出了FP-SIM，它将来自FP的空间变化像差感知集成到SIM重建流程中。FP-SIM采用分块重建模型，其中每个图块都进行独立校正。为了对不同波长（例如，荧光发射波段）进行像差校正，采用泽尼克多项式分解将FP模态的相位像差映射到荧光成像流程中。一旦所有图像块都使用各自空间变化的OTF进行重建，结果就会拼接在一起，形成一个统一的像差校正视场，如图1所示。通过测量空间变化的OTF，FP-SIM能够提供系统和样品引起的像差的详细图谱。其关键优势在于能够感知并校正多个子场中的局部像差，从而实现区域特异性校正，这是传统方法难以实现的。
为了定量评估FP-SIM的重建性能，实验分析了标准化的荧光样品，包括直径为200 nm的荧光微球(ThermoFisher, F8811)。不同方法的比较结果列于图3中。图3(a)显示了通过宽场成像、HiFi-SIM，Tiled-Wiener-SIM，以及作者的FP-SIM获得的全场重建结果，而图3(b)展示了代表性子区域的放大视图。对于Tiled-Wiener-SIM，整个视野被分割成一个11×11的图块网格（每个图块256×256像素），图块之间重叠16像素。PSF使用荧光微珠进行预校准，如图2(b)所示，按照维纳SIM重建的标准协议进行。对于HiFi-SIM，作者微调了衰减参数(attStrength)，经过多轮反复试验。
尽管Tiled-Wiener-SIM能够独立地估计每个图块的照明模式，但像差的存在不仅会影响模式参数，还会扭曲检测过程中的荧光信号。因此，会观察到明显的旁瓣伪影，如图3(c)所示。与之相反，FP-SIM通过逐块感知和校正空间变化的样本引起的畸变，有效地抑制了这些伪影。从FP获得的相应瞳孔相位图如图3(e)所示，清晰地展示了像差在整个视场中的空间变化。HiFi-SIM尝试通过光谱加权将OTF调整为理想形式来抑制旁瓣。虽然图3(c)表明，该方法虽然能够部分抑制伪影，但从根本上来说，它缺乏校正样本特异性像差的能力。因此，HiFi-SIM无法分辨图中所示的两个紧密排列的微珠。图3(d)，通过FP-SIM可以清晰地分辨出来。
利用去相关分析进一步量化了分辨率，如图3(f)和(g)所示，局部分辨率图证实，FP-SIM在整个视场范围内始终提供最高分辨率。相比之下，HiFi-SIM和Tiled-Wiener-SIM的分辨率下降程度相似，这是由于它们无法校正样品引起的像差。所有四种方法在边缘区域均观察到轻微的分辨率下降，这归因于照明渐晕。如图3(g)所示，FP-SIM测得的分辨率为478.5±26.7 nm，接近458 nm的理论极限，与宽场显微镜(894.0±16.2 nm)相比，分辨率提高了约2倍。
尽管FPM照明光穿过整个样品，但重建的像差仅由检测路径所经历的像差介质决定——即从焦平面到物镜的光路，如图4(a)所示，FPM能够感知深度特异性畸变。鉴于FPM和SIM具有相同的焦平面和光学配置，两种模式的系统级像差也保持不变。因此，作者得出结论：即使在厚且异质的生物组织中，通过FPM重建的像差也能忠实地反映影响SIM荧光检测的像差。通过对小鼠厚脑组织成像作者提出，FP-SIM能够精确地感知和校正检测路径中深度相关的像差。
为了展示FP-SIM在大样本上的能力，对固定的U2OS细胞进行了成像，视野范围为0.95 mm。如图5(a)所示，文章比较了四种方法：传统宽场荧光法、Tiled-Wiener-SIM、HiFi-SIM和作者提出的FP-SIM。对于FP-SIM，整个成像区域被分割成一个11×11的256×256像素的图块阵列，图块之间重叠16像素，从而实现了全视野范围内的空间变化像差校正。
为了进一步展示FP-SIM的多功能性和实用性，作者将该系统应用于双模态成像，同时结合荧光成像和无标记相位重建。如图6所示，FP-SIM可提供U2OS细胞的共配准图像，这些细胞分别用四种荧光染料标记，分别对应于细胞核、肌动蛋白丝、微管和线粒体外膜。荧光模式能够高特异性地定位亚细胞组分，而无标记的傅里叶叠层衍射相位模式则揭示了整体折射率分布和精细的细胞内形态。这两个通道的互补信息使得相位成像解析的结构特征能够辅助荧光信号的空间解读，从而提高亚细胞定位的准确性。这种多模态能力为在单次采集中关联分子特异性和形态背景提供了一个有效的框架。
总之，作者提出了一种名为FP-SIM的AO辅助结构光照明显微镜框架，旨在解决由样品异质性引起的空间变化像差所导致的大视场荧光成像的根本局限性。FP-SIM通过傅里叶叠层成像技术获取分块瞳孔相位，并将这些样品特异性的OTF嵌入到SIM重建中，从而显著提升了背景清晰度、减少了伪影，并提高了各种生物样本的分辨率。这些优势远超基于维纳滤波和陷波滤波的分块SIM方法，后者的全局校准PSF本质上无法适应复杂的样品特异性光学畸变。相比之下，FP-SIM无需额外硬件即可进行原位、无导星像差校正，从而为高保真荧光成像提供了一种稳健、可扩展且计算效率高的解决方案。包括标准化荧光样品、多层U2OS细胞和厚植物组织在内的综合实验表明，FP-SIM始终优于诸如瓦片式维纳SIM和HiFi-SIM等现有先进方法。作者认为，这种可迁移的、模型驱动的策略将推动像差校正领域的新进展，并极大地拓展超分辨率显微镜在复杂、动态生物系统中的应用范围。
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